RESUMO
Rhipicephalus sanguineus vem se tornando uma praga urbana, com relatos de infestações emresidências e populações resistentes a acaricidas, trazendo preocupações tanto a clínicosveterinários como também em saúde pública. Visando alternativas mais sustentáveis paraocontrole ambiental de R. sanguineus, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito invitrodoóleo essencial de cravo-da-índia, Syzygium aromaticum, sobre larvas de Rhipicephalussanguineus. Para realizar os testes foram utilizadas larvas com 15 dias de vida, sendotestadasas concentrações de 0,5%, 1% e 2% do óleo essencial. A sensibilidade das larvas foi analisadapelos testes de imersão larval (TIL) com adaptações. Foi encontrada eficácia larvicida acimade 99% sobre R. sanguineus com concentrações acima de 0,5% de óleo de S. aromaticumdiluído em solução hidroalcóolica. Demonstrando promissor efeito acaricida do óleo essencial de cravo-da-índia sobre larvas de R. sanguineus.
INTRODUÇÃO
Dentre os ixodídeos, o carrapato Rhipicephalus sanguineus temassumido relevanteimportância médico veterinária. Além das antigas preocupações quanto a vetorizaçãodedoenças infecciosas e patógenos emergentes (1,2) as crescentes infestações urbanas (3) eosrelatos de populações resistentes a acaricidas comerciais (4,5) têm trazido a ecologiaeasmedidas de controle desse ácaro para debate, bem como a urgente necessidade de métodosdecontrole mais sustentáveis. Conhecido popularmente como carrapato marrom/vermelho do cão pela sua coloração(1) é o ixodídeo mais comum em áreas urbanas no Rio Grande do Sul. Umproblemarotineiro em canis, sendo também encontrado com frequência em ambiente domiciliar eperidomiciliar de humanos que convivem com o seu principal hospedeiro, o cão doméstico(6). Estando plenamente adaptado ao clima subtropical do estado do Rio Grande doSul, vem se observando um aumento significativo de infestações por R. sanguineus emcidades, invadindo residências e havendo inclusive relatos de parasitismo em humanos, sobretudoemcrianças (3). Se tornando assim também uma preocupação de saúde pública. Para o controle ambiental ainda é comum a aplicação de pesticidas emresidênciasepátios, muitas vezes executada de maneira indiscriminada e sem orientação profissional, trazendo o risco de seleção de populações resistentes às bases químicas disponíveis na indústriafarmacológica (7). Também há o risco à saúde humana e animal, uma vez que o uso inadequadodeacaricidas representa grande parte das emergências de intoxicações acidentais de animaisdomésticos atendidas em clínicas veterinárias no Brasil (7,8). O uso indiscriminado de acaricidas também aumenta a pressão de seleção. Váriospesquisadores vêm constando nas últimas décadas cepas de R. sanguineus resistentes à várias bases químicas no Brasil (5). Dentre os estudos, recentemente foi documentado a existênciadepopulações dessa espécie resistentes à deltametrina, ivermectina, e ao fipronil emdiversoslocais da zona metropolitana de Porto Alegre, no estado do RS (4). Dentro desse contexto os óleos essenciais surgem como uma alternativa, podendoauxiliar no controle integrado de carrapatos, sendo biodegradáveis, não poluentes e de menorpoder residual (9,10). Podendo também atender a parcela de tutores que se opõemaousodeprodutos sintéticos em suas residências. O óleo de cravo-da-índia, Syzygium aromaticum é umproduto de fácil disponibilidade no mercado de óleos essenciais e rico em eugenol, composto amplamenteexplorado pela indústria farmacológica pelo seu potencial antimicrobiano e por suaspropriedades antioxidantes, e que vem sendo estudado também quanto ao seu potencial inseticida e acaricida (11). Buscando uma solução prática e de menor impacto ambiental, o presente estudotevecomo objetivo avaliar o efeito do óleo essencial de cravo-da-índia, S. aromaticum, sobre larvasde carrapato de cão, R. sanguineus.
MATERIAL E MÉTODOS
Para os ensaios de imersão larval foram utilizados como controle negativoáguadestilada, controle positivo álcool etílico a 92,8º INPM, e para o teste o óleo essencial decravo-da-índia, S. aromaticum antigo Eugenia caryophyllata, da marca dōTERRA®, obtidopor destilação a vapor dos botões florais da planta. No Laboratório de Lipidômica e Bio-orgânica, LLIBIO UFPel, foi realizadaumaanálise do extrato oleoso para identificação dos constituintes químicos. Oextrato foi diluídoem metanol de grau HPLC e injetado automaticamente em um Cromatógrafo acopladoaEspectrometria de Massas modelo GC-MS QP-2020 (Shimadzu, Kyoto, Japão) usandohéliocomo gás de arraste e uma coluna capilar RTX-5ms (Restek, Bellefonte, Estados Unidos). Para a obtenção de larvas de R. sanguineus, foram utilizadas teleóginas obtidasdeanimais que não haviam recebido tratamento acaricida há mais de 180 dias, coletadas pormédicos veterinários colaboradores do projeto e encaminhadas ao laboratório para incubação. No Laboratório de Doenças Parasitárias, LADOPAR, UFPel, as teleóginas foramlavadas em água corrente, secas em papel toalha, selecionadas quanto à viabilidadeeacondicionadas em placas de Petri sendo fixadas dorsalmente em papel comfita adesivaduplaface. Depois fixadas as teleóginas foram incubadas, e após quinze dias de incubaçãoforam coletadas as posturas e incubada a massa total de ovos em um microtubo de 2mL, dotipo Eppendorf®, com furo na tampa e vedado com tecido de nylon para passagemde ar, atéaobtenção das larvas. Para as imersões, foi primeiramente preparada uma solução hidroalcóolicanasconcentrações de 10% de álcool etílico 92,8º e água destilada, sendo esta a formulaçãodocontrole negativo e na qual foram diluídas as concentrações de 0,5%, 1%e 2%do óleo essencial de cravo-da-índia testado. Cada uma das soluções foi homogeneizada emmesaagitadora por 2 minutos. Para o controle positivo foi utilizado o acaricida comercial Colosso Fc30, compostoporfenthion, cipermetrina e 30% de clorpirifós. Foi aplicado 125µl do produto em100 ml deáguadestilada, diluição de 1:800, dose recomendada pelo fabricante. Os testes de imersão larval (TIL) foram baseados no método descrito por Shaw(12) emodificado pela EMBRAPA para estudos com óleos e extratos vegetais (13). Foi necessário adaptações na metodologia, como a incubação das posturas emumúnicotubo, preservando a integridade dos ovos e mantendo assim maior umidade ao agrupar o total da massa de ovos em um único recipiente, sem formar pequenas alíquotas emtubos individuaiscomo o realizado por outros pesquisadores (13,14). Os testes de imersão foram realizados com larvas de 15 dias de vida, contados apartirdo início da eclosão larval. Sendo formadas as alíquotas no dia dos testes, emgrupos comcercade 100 larvas, sugadas por ponteiras de 1 mL de volume adaptadas comvedação de tecidode nylon e acopladas à bomba de vácuo. Após a sucção as ponteiras foramvedadas naparteinferior com fita isolante. Em triplicatas foram realizadas as imersões em cada tratamento, adicionando 1mLdasrespectivas soluções em cada uma das ponteiras com larvas. A injeção dos tratamentosfoi facilitada perfurando o tecido de nylon que vedava extremidade superior da ponteira. Imediatamente foram adicionadas as soluções de cada tratamento, e agitadas manualmentepor10 segundos para garantir que todas as larvas ficassem imersas nas soluções. Após 5minutosde imersão, as larvas foram transferidas para envelopes de papel filtro, como auxíliodeumpincel. Os envelopes foram grampeados para vedação e secos por 30 minutos, logoapósforam acondicionados em potes conforme o tratamento recebido, agrupando as repetições. Após 24 horas foram abertos os pacotes e contadas as larvas vivas e as mortas comoauxílio da bomba de vácuo e de novas ponteiras adaptadas para a sucção das larvas. A análise estatística foi realizada por ANOVA, seguido pós-teste de múltiplacomparação de Tukey com nível de 5% de probabilidade, para comparar os valores entreosgrupos, tratados e controle. As análises foram feitas utilizando o software GraphPadPrism, versão 8.0.
RESULTADOS
O efeito acaricida das diferentes concentrações de álcool etílico 92,8º e das soluçõescontendo o óleo essencial de cravo em diferentes concentrações dos testes realizados invitrocom larvas de R. sanguineus estão demonstrados na Tabela 1. O controle negativo contendo 10% de álcool demostrou mortalidade de 0,30%. Ocontrole positivo, composto por acaricida comercial, atingiu 100% de mortalidade larval. Houve diferença estatística pelo teste de Tukey (p < 0,05) entre as médias dogrupo controle negativo, com 0,30% de mortalidade larval, e dos grupos comóleo essencial S. aromaticum, que resultaram em mortalidades acima de 99%. Não houve diferençaestatística significativa entre os tratamentos com óleo essencial e com o acaricida comercial, todos alcançando máxima mortalidade larval.
DISCUSSÃO
Foi obtida máxima mortalidade de larvas R. sanguineus, 100%, embaixasconcentrações do óleo essencial, 1% e 2%. Pela análise estatítisca a média de mortalidadedotratamento com óleo a 0,5% não teve diferença significativa dos demais tratamentos, com1%e 2% de óleo, e nem do tratamento com acaricida comercial que tambémresultouemmortalidade máxima de larvas. Resultado similar encontrado em estudo com larvas de carrapato bovino(15), Rhipicephalus (Boophilus) microplus, nas quais se alcançou mortalidades de 100%emconcentrações a partir de 0,5% com o óleo essencial de Syzygium aromaticum. O efeito acaricida desse óleo é associado à presença de eugenol, nome genéricodo4-alil-2-metoxifenol. A análise em CG-EM identificou esse composto entre os constituintesquímicos do óleo essencial testado a partir da comparação do espectro de massas geradopelabiblioteca NIST 17-S. Na Figura 1 pode-se visualizar o cromatograma com os 7 picos referentes aosconstituintes do óleo testado, os quais estão descritos na Tabela 2
Pela análise cromatográfica pode-se afirmar que o óleo testado possui os constituintescitados anteriormente, sendo o eugenol o majoritário, ocupando maior área na composiçãodoóleo testado, conforme a Tabela 2. O eugenol é um produto natural encontrado em maior quantidade no cravo-da-índia, Eugenia caryophyllata sinonímia botânica Syzygium aromaticum. Por isso escolhidofoi opara o estudo, mas sabe-se que esse composto também pode ser abundante emdiversas outrasplantas aromáticas (16), como na Pimenteira-da-jamaica (Pimenta dioica, Myrtaceae), naNoz-moscada (Myristica fragans, Myristicaceae), na Canela (Cinamomumverum, Lauraceae)(17) e em Lamiaceae (18) como a alfavaca (Ocimum gratissimum) e o manjericão(O. basilicum), sendo muitas dessas especiarias naturais cultivadas mundialmente e, defácil extração e disponibilidade no mercado de óleos essenciais.
Esse composto vem sendo amplamente estudado e explorado pela indústriafarmacológica, já incorporada a produtos alimentícios, cosméticos e produtos odontológicos, por apresentar relevante potencial antimicrobiano além de ações antioxidantes. Sendocrescentes os estudos e o número de registro de patentes com eugenol nas últimas décadas(11). Sabe-se que esse composto também apresenta propriedades nematicidas elarvicidas, porém esse potencial biológico tem sido timidamente explorado, corroborandopara que novas pesquisas sejam desenvolvidas (19). Quanto a ação acaricida, estudos vêm demonstrando a eficácia tanto do eugenol isolado de cravo-da-índia assim como de seu óleo essencial sobre teleóginas e larvasdecarrapato bovino, R. microplus, e de outras espécies de ixodídeos (20-22). Já emcarrapatode cão, existem poucos trabalhos, sendo a maioria deles com o Eugenol purificadoetestado em associação com outros compostos de interesse industrial como o timol (20)cinamaldeído e o carvacrol (23). Comparando o efeito acaricida do eugenol purificado com o óleo essencial de cravo-daíndia em carrapatos, pesquisadores vêm observando que o componente extraído e purificadonão proporciona superioridade significativa na eficácia acaricida do que o óleo essencial deS. aromaticum (15,24), já que o eugenol é seu composto majoritário. Sendo assim o óleo essencial de cravo-da- índia a melhor alternativa. Uma vez queseuóleo essencial é um produto de mais fácil acesso, menor custo, de alto rendimento no processoextrativo e de menor impacto ambiental, não necessitando o uso de solventes orgânicosnecessários para a obtenção do eugenol purificado (15). A solução testada foi de fácil elaboração, utilizando produtos de ampla disponibilidadeno mercado, o que facilita a repetição dessa solução em futuros ensaios. De acordo com os resultados obtidos, o óleo essencial de cravo-da-índia, S. aromaticum, diluído em soluções hidroalcoólicas demonstrou ser uma alternativapromissora para o controle desse carrapato. Exercendo máxima ação acaricida sobrelarvas não alimentadas de R. sanguineus em baixas concentrações, a partir de 0,5%. Restando ainda descobrir a menor dose efetiva sobre larvas de R. sanguineus, bemcomoestudos de repelência larval e tempo de ação residual desse óleo, bemcomo de ensaiosdetoxicidade do eugenol e dos demais componentes presentes no óleo essencial testado.
CONCLUSÕES
O óleo essencial de Syzygium aromaticum em doses a partir de 0,5%de concentração, diluído em solução hidroalcóolica, demonstrou excelente ação acaricida sobre larvasde Rhipicephalus sanguineus em ensaios in vitro. Os resultados encontrados sãoimportantes no campo da saúde única, podendo futuramente ser uma alternativamaissustentável para o controle de infestações ambientais pelo carrapato-vermelho-do-cão.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao professor Martin Pereira de Pereira e ao Laboratório de LipidômicaeBio-orgânica da UFPel pelo estudo cromatográfico, ao pesquisador Marcos ValérioGarcia pelo apoio e orientações quanto aos testes e incubação de carrapatos, a todososcolaboradores que doaram as amostras de carrapatos e ao Laboratório de Doenças Parasitáriasda UFPel pela estrutura e equipamentos cedidos.
REFERÊNCIAS
1. Marusik YM, Böcher J, Makarova O, Gerecke R, Behan-Pelletier V. Arachnida. In: Saari S, Näreaho A, Nikander S. Canine Parasites and Parasitic Diseases. Cambridge: AcademicPress; 2018. Chap. 9, p. 187-228. doi: 10.2307/2465. 2. Parola P, Socolovschi C, Jeanjean L, Bitam I, Fournier PE, Sotto A, et al. Warmer weatherlinked to tick attack and emergence of severe Rickettsioses. PLoS Negl Trop Dis. 2008;2(11):1-8. doi: 10.1371/journal.pntd.0000338. 3. Aguiar CLG, Pinto DM, Pappen FG, Cunha Filho NA, Santos TRB, Faria NAR. Parâmetros da fase de vida livre de Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806)Acari:Ixodidae): adaptado ao clima subtropical. Arq Inst Biol. 2013;80(4):375-80. doi: 10.1590/s1808-16572013000400001. 4. Becker S, Webster A, Doyle RL, Martins JR, Reck J, Klafke GM. Resistancetodeltamethrin, fipronil and ivermectin in the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineussensu stricto, Latreille (Acari: Ixodidae). Ticks Tick Borne Dis. 2019;10(5):1046-50. doi: 10.1016/j.ttbdis.2019.05.015. 5. Borges MF, Soares SF, Fonseca IN, Chaves VV, Cristina C, Louly B. Resistência acaricidaem larvas de Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) de Goiânia-GO, Brasil. RevPatol Trop [Internet]. 2007 [cited 15 Mar 2022];36(1):87-95. Available from: https://repositorio.bc.ufg.br/bitstream/ri/166/1/ACARICIDE.pdf 6. Mendes TM, Balbino JNF, Silva NCT, Farias LA. Rhipicephalus (Boophilus) micropluseRhipicephalus sanguineus: uma revisão sobre as perspectivas, distribuição e resistênciaRhipicephalus (Boophilus) microplus and Rhipicephalus sanguineus: a reviewontheprospects, distribution and resistance. PUBVET. 2019;13(6):1-9. doi:10.31533/pubvet.v13n6a347.1-9 7. Lázaro SF, Fonseca LD, Fernandes RC, Tolentino JS, Martins ER, Duarte ER. Efeitodoextrato aquoso do algodão de seda (Calotropis procera Aiton) sobre a eficiênciareprodutiva do carrapato bovino. Rev Bras Plantas Med. 2012;14(2):302-5. doi: 10.1590/S1516-05722012000200008. 8. Melo MM, Oliveira NJF, Lago LA. Intoxicações causadas por pesticidas emcães e gatos. Parte II: amitraz, estricnina, fluoracetado de sódio e fluoracetamida, rodenticidasanticoagulantes e avermectinas. Rev Educ Contin Med Vet Zootec CRMV-SP. 2002;5(3):259-67. doi: 0.36440/recmvz.v5i3.3292. ISSN Eletrônico 2178-3764 Veterinária e Zootecnia9Segalla CC, Pinheiro NB, Ferraz A, Poletti T, Ongaratto R, Ribeiro CM et al. Estudo in vitro da eficácia doóleoessencial de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum, Myrtaceae) sobre fase larval de Rhipicephalus sanguineus. Vet. e Zootec. 2022 ; v29: 001-010. 9. Chagas ACS, Passos WM, Prates HT, Leite RC, Furlong J, Fortes ICP. Efeito acaricidadeóleos essenciais e concentrados emulsionáveis de Eucalyptus spp emBoophilus microplus. Braz J Vet Res Anim Sci. 2002;39(5):247-53. doi: 10.1590/s1413-95962002000500006. 10. Salman M, Abbas RZ, Israr M, Abbas A, Mehmood K, Khan MK, et al. Repellent andacaricidal activity of essential oils and their components against Rhipicephalus ticksincattle. VetParasitol [Internet]. 2020;283:109178. doi: 10.1016/j.vetpar.2020.109178. 11. Fernandes MJG, Pereira RB, Pereira DM, Fortes AG, Castanheira EMS, Gonçalves MST. New eugenol derivatives with enhanced insecticidal activity. Int J Mol Sci. 2020;21(9257):1-14. doi: 10.3390/ijms21239257. 12. Mendes EC, Mendes MC, Sato ME. Diagnosis of amitraz resistance in Brazilianpopulations of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) withlarval immersion test. Exp Appl Acarol. 2013;61:357-69. doi:10.1007/s10493-013-9697-3. 13. Andreotti R, Koller WW, Garcia MV. Carrapatos: protocolos e técnicas para estudo. Brasília: Embrapa; 2016. 14. Sabatini GA, Kemp DH, Hughes S, Nari A, Hansen J. Tests to determine LC50anddiscriminating doses for macrocyclic lactones against the cattle tick, Boophilus microplus. Vet Parasitol. 2001;95(1):53-62. doi: 10.1016/S0304-4017(00)00406-4. 15. Ferreira FM, Delmonte CC, Novato TLP, Monteiro CMO, Daemon E, Vilela FMP, et al. Acaricidal activity of essential oil of Syzygium aromaticum, hydrolate and eugenol formulated or free on larvae and engorged females of Rhipicephalus microplus. MedVet Entomol. 2018;32(1):41-7. doi: 10.1111/mve.12259. 16. Oliveira RA, Reis TV, Sacramento CK, Duarte LP, Oliveira FF. Constituintes químicosvoláteis de especiarias ricas em eugenol. Rev Bras Farmacogn. 2009;19(3):771-5. doi: 10.1590/s0102-695x2009000500020. 17. Castro CC, Silva ARC, Franco CJP, Siqueira GM, Cascaes MM, Nascimento LD, et al. Caracterização química do óleo essencial das folhas, galhos e frutos de Cinnamomumverum J. Presl (Lauraceae). Braz J Dev. 2020;6(6):41320-33. doi: 10.34117/bjdv6n6-609. 18. Pereira CAM, Maia JF. Estudo da atividade antioxidante do extrato e do óleo essencial obtidos das folhas de alfavaca (Ocimum gratissimum L.). Food Sci Technol. 2007;27(3):624-32. doi: 10.1590/S0101-20612007000300030. 19. Sousa PSA, Rodrigues MG, Alvarenga EM. Prospecção tecnológica comênfasenasatividades biológicas nematicida e larvicida do óleo essencial do cravo-da-índiaedoeugenol. Cad Prospeccao. 2020;13(1):154-70. doi: 10.9771/cp.v13i1.29624. 20. Coelho L, Paula LGF, Alves SGA, Sampaio ALN, Bezerra GP, Vilela FMP, et al. Combination of thymol and eugenol for the control of Rhipicephalus sanguineus sensulato: Evaluation of synergism on immature stages and formulation development. Vet Parasitol. 2020;277:108989. doi: 10.1016/j.vetpar.2019.108989. 21. De Monteiro CM, Maturano R, Daemon E, Catunda FEA, Calmon F, De Souza SenraT, et al. Acaricidal activity of eugenol on Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) and ISSN Eletrônico 2178-3764 Veterinária e Zootecnia10Segalla CC, Pinheiro NB, Ferraz A, Poletti T, Ongaratto R, Ribeiro CM et al. Estudo in vitro da eficácia doóleoessencial de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum, Myrtaceae) sobre fase larval de Rhipicephalus sanguineus. Vet. e Zootec. 2022 ; v29: 001-010. Dermacentor nitens (Acari: Ixodidae) larvae. Parasitol Res. 2012;111(3):1295-300. doi: 10.1007/s00436-012-2964-0. 22. Valente PP, Amorim JM, Castilho RO, Leite RC, Ribeiro MFB. In vitro acaricidal efficacy of plant extracts from Brazilian flora and isolated substances against Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Parasitol Res. 2014;113(1):417-23. doi: 10.1007/s00436-013-3670-2. 23. Senra TOS, Calmon F, Zeringóta V, Monteiro CMO, Maturano R, Matos RS, et al. Investigation of activity of monoterpenes and phenylpropanoids against immature stagesof Amblyomma cajennense and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Parasitol Res. 2013;112(10):3471-6. doi: 10.1007/s00436-013-3527-8. 24. Lambert MM, de Almeida Chaves DS, de Avelar BR, Campos DR, Borges DA, MoreiraLO, et al. In vitro evaluation of the acaricidal activity of Syzygiumaromaticum(L.)essential oil and eugenol against non-fed larvae of Rhipicephalus sanguineus. RevBrasMed Vet. 2021;43(1):e002620. doi: 10.29374/2527-2179.BJVM002620
